Određivanje oksidativnog stresa ejakulata
Dr.sc. Igor Matić, klinički embriolog
Poliklinika IVF
Jedan od glavnih uzroka oštećenja DNA molekule (eng. DNA fragmentation) i muške neplodnosti je prisutnost reaktivnih kisikovih spojeva (ROS, prema eng. Reactive Oxygen Species)(1). Ejakulat se sastoji od više vrsta različitih stanica kao što su zreli i nezreli spermiji, leukociti i epitelne stanice. Dva glavna izvora ROS-ova u ejakulatu su leukociti (vanjski izvor) i spermiji (unutarnji izvor). Unutarnji izvor ROS-ova povezan je s promjenama u spermijima kao što je DNA fragmentacija (2, 3, 4). Pojačana DNA fragmentacija rezultira slabijim razvitkom embrija i pobačajem (8). ROS-ovi mogu oštetiti membranu spermija uzrokujući slabu pokretljivost spermija i slabiju fertilizaciju (7).
Česti uzrok oksidativnog stresa povezuje se sa zagađenim okolišem (teški metali i slično), nezdravim načinom života (debljina, pušenje, alkoholizam) kao i nekim zdravstvenim stanjima kao što je varkikokela, ozlijeda leđne moždine i urogenitalnim infekcijama (5). Potvrđena je povećana prisutnost ROS-ova kod muškaraca starijih od 40 godina (6).
Sukladno naprednim svjetskim preporukama, naš laboratorij savjetuje provjeru oksidativnog stresa ejakulata u muškaraca kod kojih je koncentracija spermija manja od 15 miliona/ml (OLIGOZOOSPERMIA), a kod kojih je udio progresivno pokretnih spermija manji od 32 % (ASTHENOZOOSPERMIA) ili je morfologija manja od 15 % (TERATOZOOSPERMIA). Pacijenti stariji od 40 godina, pušači te pacijenti koji imaju varikokelu bi također trebali provjeriti oksidativni status ejakulata.
Ovaj test mjeri prisutnost superoksid aniona (O2–) u ejakulatu. Pretraga se bazira na reakciji nitro plave tetrazolijeve (engl. NitroBlue Tetrazolium) soli topive u vodenim otopinama s anionima superoksida iz spermija pri čemu nastaju netopivi plavi kristali formazana (Slika 2). Kristali nastaju unutar stanica spermija, ali su istog trena otopljeni u posebnom otapalu gdje se procjenjuje boja takve otopine, od blago žute pa sve do intezivno ljubičasto-plave (Slika 1). Jačina boje proporcionalna je jačini oksidativnog stresa ejakulata.
Slika 1: Prikaz inteziteta boje ovisno o razini oksidativnog stresa ejakulta (preuzeto od http://www.halotechdna.com)
Slika 2: Prikaz spermija koji su u oksidativnom stresu (affected) te talože plave kristale formazana u membrani. Spermiji koji nisu oštećeni oksidativnim stresom ne talože formazan (non affected). Što je veći broj istaloženih soli formazana, to je intezitet otopine jači. (preuzeto i promijenjeno od http://www.halotechdna.com).
Razina oksidativnog stresa se dijeli u 4 grupe (N1 do N4) (Slika 1). Oksidativni stres gupe N1 i grupe N2 (niski oksidativni stres) smatra se optimalnom/niskom razinom ROS-ova te ne oštećuje stanice. Grupe N3 i N4 potvrđuju visoki oksidativni stres koji oštećuje spermatogenezu.
Mnoge su studije pokazale da korištenje nekog oblika antioksidanta poboljšavaju integritet DNA molekule (9, 10) i uspješnost začeća (11). Zabilježeno je značajnije poboljšanje plodnosti u prirodnom začeću kao i kod medicinski pomognute oplodnje (IVF/ICSI). Ukoliko se dokaže pojačani oksidativni stres u ejakulatu, predlaže se terapija preparatima koji štite stanice spermatogeneze od oksidativnog stresa i dostupni su u ljekarnama.
LITERATURA
- R. J. Aitken and G. N. de Iuliis, “On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa,” Molecular Human Reproduction, vol. 16, no. 1, Article IDgap059, pp. 3–13, 2009.
- R. Henkel, E. Kierspel, T. Stalf et al., “Effect of reactive oxygen species produced by spermatozoa and leukocytes on sperm functions in non-leukocytospermic patients,” Fertility and Sterility, vol. 83, no. 3, pp. 635–642, 2005
- G. Aktan, S.Dogru-Abbasoglu, C.Kucukgergin, A.Kadıoglu, G. Ozdemirler-Erata, and N. Kocak-Toker, “Mystery of idiopathic male infertility: is oxidative stress an actual risk?” Fertility and Sterility, vol. 99, no. 5, pp. 1211–1215, 2013.
- Iommiello VM1, Albani E1, Di Rosa A1, Marras A1, Menduni F1, Morreale G1, Levi SL1, Pisano B1, Levi-Setti PE1., „Ejaculate oxidative stress is related with sperm DNA fragmentation and round cells,“ Int J Endocrinol. 2015;2015:321901. doi: 10.1155/2015/321901. Epub 2015 Feb 23.
- M. Cocuzza, S. C. Sikka, K. S. Athayde, and A. Agarwal, “Clinical relevance of oxidative stress and sperm chromatin damage in male infertility: an evidence based analysis,” International Brazilian Journal of Urology, vol. 33, no. 5, pp. 603–621, 2007.
- M. Cocuzza, K. S. Athayde, A. Agarwal et al., “Age related increase of reactive oxygen species in neat semen in healthy fertile men,” Urology, vol. 71, no. 3, pp. 490–494, 2008.
- R. J. Aitken, “The roe of free oxygen radicals and sperm function,” International Journal of Andrology, vol. 12, no. 2, pp. 95–97, 1989.
- B. Ozmen, N. Koutlaki, M. Youssry, K. Diedrich, and S. Al- Hasani, “DNAdamage of humanspermatozoa inassisted reproduction: origins, diagnosis, impacts and safety,” Reproductive BioMedicine Online, vol. 14, no. 3, article 2730, pp. 384–395, 2007.
- E. Greco, M. Iacobelli, L. Rienzi, F. Ubaldi, S. Ferrero, and J. Tesarik, “Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment,” Journal of Andrology, vol. 26, no. 3, pp. 349–353, 2005.
- Y. J. R. M´en´ezo, A. Hazout, G. Panteix et al., “Antioxidants to reduce sperm DNA fragmentation: an unexpected adverse effect,” Reproductive BioMedicine Online, vol. 14, no. 4, article 2669, pp. 418–421, 2007.
- E. Greco, S. Romano,M. Iacobelli et al., “ICSI in cases of sperm DNA damage: beneficial effect of oral antioxidant treatment,” Human Reproduction, vol. 20, no. 9, pp. 2590–2594, 2005.