Određivanje oksidativnog stresa ejakulata

Dr.sc. Igor Matić, klinički embriolog

Poliklinika IVF

Jedan od glavnih uzroka oštećenja DNA molekule (eng. DNA fragmentation) i muške neplodnosti je prisutnost reaktivnih kisikovih spojeva (ROS, prema eng. Reactive Oxygen Species)(1). Ejakulat se sastoji od više vrsta različitih stanica kao što su zreli i nezreli spermiji, leukociti i epitelne stanice. Dva glavna izvora ROS-ova u ejakulatu su leukociti (vanjski izvor) i spermiji (unutarnji izvor).  Unutarnji izvor ROS-ova povezan je s promjenama u spermijima kao što je DNA fragmentacija (2, 3, 4). Pojačana DNA fragmentacija rezultira slabijim razvitkom embrija i pobačajem (8). ROS-ovi mogu oštetiti membranu spermija uzrokujući slabu pokretljivost spermija i slabiju fertilizaciju (7).

Česti uzrok oksidativnog stresa povezuje se sa zagađenim okolišem (teški metali i slično), nezdravim načinom života (debljina, pušenje, alkoholizam) kao i nekim zdravstvenim stanjima  kao što je varkikokela, ozlijeda leđne moždine i urogenitalnim infekcijama (5). Potvrđena je povećana prisutnost ROS-ova kod muškaraca starijih od 40 godina (6).

Sukladno naprednim svjetskim preporukama, naš laboratorij savjetuje provjeru oksidativnog stresa ejakulata u muškaraca kod kojih je koncentracija spermija manja od 15 miliona/ml (OLIGOZOOSPERMIA), a kod kojih je udio progresivno pokretnih spermija manji od 32 % (ASTHENOZOOSPERMIA) ili je morfologija manja od 15 % (TERATOZOOSPERMIA). Pacijenti stariji od 40 godina, pušači te pacijenti koji imaju varikokelu bi također trebali provjeriti oksidativni status ejakulata.

Ovaj test mjeri prisutnost superoksid aniona (O₂^–) u ejakulatu. Pretraga se bazira  na reakciji nitro plave tetrazolijeve (engl. NitroBlue Tetrazolium) soli topive u vodenim otopinama s anionima superoksida iz spermija pri čemu nastaju netopivi plavi kristali formazana (Slika 2). Kristali nastaju unutar stanica spermija, ali su istog trena otopljeni u posebnom otapalu gdje se procjenjuje boja takve otopine, od blago žute pa sve do intezivno ljubičasto-plave (Slika 1). Jačina boje proporcionalna je jačini oksidativnog stresa ejakulata.

Slika 1: Prikaz inteziteta boje ovisno o razini oksidativnog stresa ejakulta (preuzeto od http://www.halotechdna.com)

Slika 2: Prikaz spermija koji su u oksidativnom stresu (affected) te talože plave kristale formazana u membrani. Spermiji koji nisu oštećeni oksidativnim stresom ne talože formazan (non affected). Što je veći broj istaloženih soli formazana, to je intezitet otopine jači. (preuzeto i promijenjeno od http://www.halotechdna.com).

Razina oksidativnog stresa se dijeli u 4 grupe (N1 do N4) (Slika 1). Oksidativni stres gupe N1 i grupe N2 (niski oksidativni stres) smatra se optimalnom/niskom razinom ROS-ova te ne oštećuje stanice. Grupe N3 i N4 potvrđuju visoki oksidativni stres koji oštećuje spermatogenezu.

Mnoge su studije pokazale da korištenje nekog oblika antioksidanta poboljšavaju integritet DNA molekule (9, 10) i uspješnost začeća (11). Zabilježeno je značajnije poboljšanje plodnosti u prirodnom začeću kao i kod medicinski pomognute oplodnje (IVF/ICSI). Ukoliko se dokaže pojačani oksidativni stres u ejakulatu, predlaže se terapija preparatima koji štite stanice spermatogeneze od oksidativnog stresa i dostupni su u ljekarnama.

LITERATURA

1. R. J. Aitken and G. N. de Iuliis, “On the possible origins of DNA damage in human spermatozoa,” Molecular Human Reproduction, vol. 16, no. 1, Article IDgap059, pp. 3–13, 2009.
2. R. Henkel, E. Kierspel, T. Stalf et al., “Effect of reactive oxygen species produced by spermatozoa and leukocytes on sperm functions in non-leukocytospermic patients,” Fertility and Sterility, vol. 83, no. 3, pp. 635–642, 2005
3. G. Aktan, S.Dogru-Abbasoglu, C.Kucukgergin, A.Kadıoglu, G. Ozdemirler-Erata, and N. Kocak-Toker, “Mystery of idiopathic male infertility: is oxidative stress an actual risk?” Fertility and Sterility, vol. 99, no. 5, pp. 1211–1215, 2013.
4. Iommiello VM1, Albani E1, Di Rosa A1, Marras A1, Menduni F1, Morreale G1, Levi SL1, Pisano B1, Levi-Setti PE1., „Ejaculate oxidative stress is related with sperm DNA fragmentation and round cells,“ Int J Endocrinol. 2015;2015:321901. doi: 10.1155/2015/321901. Epub 2015 Feb 23.
5. M. Cocuzza, S. C. Sikka, K. S. Athayde, and A. Agarwal, “Clinical relevance of oxidative stress and sperm chromatin damage in male infertility: an evidence based analysis,” International Brazilian Journal of Urology, vol. 33, no. 5, pp. 603–621, 2007.
6. M. Cocuzza, K. S. Athayde, A. Agarwal et al., “Age related increase of reactive oxygen species in neat semen in healthy fertile men,” Urology, vol. 71, no. 3, pp. 490–494, 2008.
7. R. J. Aitken, “The roe of free oxygen radicals and sperm function,” International Journal of Andrology, vol. 12, no. 2, pp. 95–97, 1989.
8. B. Ozmen, N. Koutlaki, M. Youssry, K. Diedrich, and S. Al- Hasani, “DNAdamage of humanspermatozoa inassisted reproduction: origins, diagnosis, impacts and safety,” Reproductive BioMedicine Online, vol. 14, no. 3, article 2730, pp. 384–395, 2007.
9. E. Greco, M. Iacobelli, L. Rienzi, F. Ubaldi, S. Ferrero, and J. Tesarik, “Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment,” Journal of Andrology, vol. 26, no. 3, pp. 349–353, 2005.
10. Y. J. R. M´en´ezo, A. Hazout, G. Panteix et al., “Antioxidants to reduce sperm DNA fragmentation: an unexpected adverse effect,” Reproductive BioMedicine Online, vol. 14, no. 4, article 2669, pp. 418–421, 2007.
11. E. Greco, S. Romano,M. Iacobelli et al., “ICSI in cases of sperm DNA damage: beneficial effect of oral antioxidant treatment,” Human Reproduction, vol. 20, no. 9, pp. 2590–2594, 2005.