Genetska analiza embrija

 

Genetska analiza embrija

 

Genomske analize DNK uključuju preimplantacijsku genetičku dijagnozu (eng. Preimplantation genetic diagnosis – PGD) i preimplantacijski genetički probir (eng. Preimplantation genetic screening – PGS). Osnova PGD-a i PGS-a uključuje genetsku analizu embrija prije implantacije i prijenos odabranih „normalnih” embrija. Prva uspješna primjena PGD-a za nasljedne bolesti objavljena je 1990. (Handyside, Kontogianni et al., 1990.). Za primjenu PGD/PGS-a pacijenti se moraju koristiti IVF postupkom da bi stvorili embrije in vitro za analizu. Za dijagnostiku su opisana tri različita razvojna stadija: polarna tjelešca odstranjena od oocite/zigote (eng. polar body biopsy), blastomere 6-8-staničnog zametka (treći dan, eng. Cleavage stage biopsy), ili biopsija trofektodermskih stanica blastociste (5 ili 6 dana razvija, eng. Blastocyst biopsy) (sl. 1.).

Slika 1.

U principu, biopsirani se uzorci analiziraju pomoću PCR-a (polymerase chain reaction) ili FISH-a (fluorescence in situ hybridization) relevantnih tehnika. PCR tehnike primjenjuju se za dijagnozu specifičnih genskih bolesti, dok su FISH tehnike za analizu broja kromosoma u pacijenata s kromosomskim anomalijama ili za spolnu selekciju embrija za bolesti koje se prenose na X-kromosomu (Handyside, 2010.; Harper and Harton, 2010.).

 

PREIMPLANTACIJSKA GENETSKA DIJAGNOSTIKA – PGD

PGD je važan znanstveni napredak za pacijente koji su nosioci genskih bolesti, i koji su u riziku za prijenos nasljednih bolesti (npr. hemofilija, cistična fibroza, fragile X, Duchenneova muskularna distrofija itd.). Izvještaj ESHRE – PGD udruženja pokazuje da je od 1997. do 2007. obavljeno više od 4 000 PGD postupaka u Europi, s postotkom trudnoća od 29%/ET (Harper, Wilton etal., 2012.).

Postotak je PGD postupaka u porastu svake godine i rezultat je novih i uspješnih metoda detekcije abnormalnih gena na razini jedne blastomere i kompletiranja sekvencije humanog genoma. Jedna od tehnika koje su razvijene nedavno jest amplifikacijacijelog genoma (eng. Whole Genome Amplification), (Handyside, Robinson et al., 2004.). Ova metoda omogućuje skupljanje mikrograma DNK od jedne blastomere, i primjenu microarrays analize cijelog genoma.

To je vrlo važno za detekciju kromosomskih anomalija, mutacija i aneuploidija. U indikaciji za PGD biopsija se radi treći dan razvoja embrija (osmerostanični zametak), na jednoj ili dvjema blastomerama, a transferira se „normalan” zametak petog ili šestog dana.

Danas se PGD primjenjuje u mnogim zemljama i znači mogućnost izbjegavanja genskih bolesti u obitelji. Detaljno praćenje djece rođene nakon PGD-a ne upućuje na povećanje kongenitalnih anomalija (Goossens, Harton et al., 2009.). Znanstvenici u SAD u pokazuju da bi, u slučaju cistične fibroze (CF), ako se uvede besplatan IVF-PGD za sve nosioce, ušteda bila nekoliko bilijuna dolara (Tur-Kaspa, Aljadeff et al., 2010.).

 

PREIMPLANTACIJSKI  GENETSKI SCREENING– PROBIR – PGS

PGS, za razliku od PGD-a, razvijen je za poboljšanje uspješnosti IVF-a, posebno u žena starije dobi.

Indikacije za PGSuključuju:

  • pacijentice starije dobi,
  • višestruke pobačaje, ponavljane
  • neuspjehe IVF-a i
  • mušku neplodnost (Goossens, Harton et al., 2009.).

U pacijentica starije dobi (> 35) učestalost je aneuploidija (gubitak ili dobitak kromosoma) povećana i jedan je od glavnih uzroka smanjenja prirodnih i IVF trudnoća (Hassold and Hunt, 2001.). Mejotičke (prvo i drugo polarno tijelo) i mitotičke greške (prva i druga dioba) glavni su uzroci aneuploidija. Za detekciju aneuploidija (kromosomskoga broja) početno se primjenjivala fluorescencein-situ hybridization (FISH).

Prvi slučajevi PGS-a uključuju analize polarnih tjelešaca (Verlinsky, Cieslak et al., 1995.), (Munne, Dailey et al., 1995.) i blastomera (Munne, Sultan et al., 1995.). Dosada više od 11 randomiziranih kontrolnih studija ne pokazuje povišenje trudnoća i prirast djece primjenom PGS-a (Harper and Harton, 2010.), (Mastenbroek, Twisk et al., 2011.), (Harper, Magli et al., 2012.).

Jedan od glavnih uzroka neučinkovitosti PGS-a jest da je biopsija blastomera trećeg dana stadij koji se odlikuje visokim stupnjem aneuploidija i mozaicizma (Munne, Sultan et al., 1995.), (Harper, Coonen et al., 1995.). Stoga analiza jedne blastomere ne može utvrditi kromosomski status cijelog embrija.

Kromosomski je mozaicizam fenomen u kojemu blastomere višestaničnog zametka (trećeg dana) nemaju isti kromosomski sadržaj (Delhanty, Griffin et al., 1993.). Više od 70% humanih embrija je mozaično, od toga 50% čine diploidni-annuploidni, a 14 % totalno aneuploidni u svim blastomerama (van Echten-Arends, Mastenbroek et al., 2011.). Zbog toga je primjena PGS-a trenutačno usmjerena na analizu polarnih tjelešaca ili trofektoderma (Geraedts, Collins et al., 2010.; Harper, Magli et al., 2012.). Međutim, noviji rezultati upućuju isto tako na pojavu mozaicizma u blastocistama (Fragouli, Alfarawatiet al., 2011.). FISH metoda razvijena je za analizu uzoraka s mnogo stanica (npr. limfociti), a ne za analizu jedne stanice. Posljedice su lažno pozitivni i lažno negativni rezultati. FISH metodom može se analizirati samo 5-12 kromosoma od 24 kromosoma, te se ta metoda polako napušta.

Za poboljšanje rezultata i kvalitete PGS-a primjenjuju se nove metode za analizu sva 24 kromosoma i optimalni stadiji embrija za biopsiju. Analiza polarnih tjelešaca i trofektoderma blastociste sve je popularnija u kombinaciji s novim metodama analize 24 kromosoma. Komparativna genomska hibridizacija(eng. Comparative Genomic Hybridization – CGH), array–CGH i metoda polimorfizma jednog nukleotida(eng. Single Nucleotide Polymporphism – SNP array) nove su metode za analizu sva 24 kromosoma, i sada su u procesu testiranja i evaluacije, s pozitivnim inicijalnim rezultatima (Hellani, Abu-Amero et al., 2008.; Alfarawati, Fragouli et al., 2011.). CGH se bazira na fluorescentnom bojenju kromosoma i na kompetenciji normalnih kromosoma kontrolnih uzoraka s kromosomima testiranih uzoraka. Kompjutorski program analizira omjer fluorescentnih signala između uzoraka za detekciju aneuploidija (Wilton, Voullaire et al., 2003.; Schoolcraft, Fragouli et al., 2010.). Array–CHG (poznat kao karyomaping) radi na istom principu kao CGH, ali se koristi DNK čipom (artificijelni kromosom bakterije – BAC) za specifičnu regiju kromosoma (Handyside, Harton et al., 2010,.).

Jedan od problema CGH metoda jest nemogućnost detekcije poliploidija (kao triploidija) i nemogućnost detekcije kromosomskih translokacija ili inverzija. Za razliku od CGH-a, SNP metodebaziraju se na spoznaji da se određene regije u ljudskom genomu razlikuju između osoba. Tako se jednu osobu od druge može ratlikovati na razini kromosoma. Blagodat te metode jest da se može odrediti ukupan broj kromosoma u stanici i njihovo roditeljsko podrijetlo. Isto tako je moguće istodobno testiranje za specifičnu gensku bolest i aneuploidiju. Tom je metodom utvrđeno podrijetlo aneuploidija u preimplantacijskom ljudskom embriju, gdje su trisomije u embriju većinom materinskog porijekla. Nastaju u mejozi i povećavaju se s pacijentičinim godinama (Rabinowitz, Ryanet al., 2012.).

Metoda je stekla popularnost u SAD-u, ali kao i kod CGH-a, randomizirane kontrolne studije nužne su prije nego postanu kliničke metode (Handyside, 2011.). Zanimljivo je pitanje postoji li povezanost između razvoja (morfologije) embrija i aneuploidija. Je li moguće selekcionirati abnormalne (aneuploidne) embrije na osnovi morfologije? Analize u Cornellu upućuju na to da embriji koji dosegnu stadij blastociste petog dana imaju 50 posto vjerojatnosti da budu normalni (FISH analiza dan 3). Embriji koji nisu blastociste petog dana (zaostali ili spori) 77% su aneuploidni, a oni koji su prestali razvoj 85% su abnormalni. Objavljeni su rezultati koji upućuju na povezanost stupnja razvoja zametka s „genetičkim zdravljem” (Rubio, Simon et al., 2003.), (Alfarawati, Fragouli et al., 2011.). Kako su aneuploidne većinom mejotičke, moguće je da njihov negativan učinak na razvoj i morfologiju embrija počinje nakon genske aktivacije (oko drugog ili trećeg dana) i reflektira se na razvoj do blastociste. Rutinska evaluacija razvoja embrija: morfologije, broja stanica i kinetike razvoja pomaže selekciji abnormalnih embrija ako se ne primjenjuje genska analiza (Wells, 2010.). Kultura embrija do blastociste vjerojatno eliminira većinu postmejotičkih abnormalnosti, ali ne i aneuploidije.

 

Izvor: Šimunić i suradnici:   Reprodukcijska  endokrinologija i neplodnost

Izvantjelesna oplodnja-IVF

FotoSoft, 2012